实验技术 生物化学 细胞生物学 荧光成像 钙离子

Fura-2-AM（弗拉-2-乙酰氧甲基酯）

• Fura-2AM, 活细胞, 细胞成像, 荧光探针, 钙离子

结构与特性

Fura-2-AM 是一种非极性分子，其乙酰氧甲基 (AM) 酯基能够使其穿透细胞膜。一旦进入细胞，细胞内的酯酶会将其水解，移除 AM 酯基，释放出 Fura-2。Fura-2 是一个亲水性的、带有负电荷的分子，不能自由地穿过细胞膜，因此被困在细胞内。Fura-2 本身对钙离子具有高亲和力，其结合钙离子后，其吸收光谱会发生改变，这使得它能够用于钙离子浓度的测量。

应用与优势

Fura-2AM 的主要应用在于活细胞内钙离子成像。通过使用荧光显微镜，可以测量 Fura-2 在不同激发波长下的荧光强度比值，从而实现对细胞内钙离子浓度的定量测量。这种比值测量方法具有以下优势：

  • 不受细胞内染料浓度差异的影响：由于测量的是荧光比值，而不是绝对荧光强度，因此即使细胞内染料分布不均匀，或者染料发生光漂白，也不会影响测量结果的准确性。
  • 减少实验误差：比值测量方法可以校正由于仪器不稳定或光路变化引起的误差。
  • 高灵敏度：Fura-2 对钙离子具有较高的亲和力，即使在低钙浓度下，也能实现有效的检测。

实验流程

使用 Fura-2AM 进行钙离子成像的典型流程包括：

  1. 染料制备：将 Fura-2AM 溶解于适当的溶剂中，如 DMSO。
  2. 细胞加载：将 Fura-2AM 加入细胞培养基中，并孵育一段时间（通常为 30-60 分钟），使染料进入细胞。
  3. 清洗细胞：用培养基清洗细胞，去除细胞外的 Fura-2AM。
  4. 钙离子成像：使用荧光显微镜，在两个不同的激发波长下（例如，340 nm 和 380 nm）对细胞进行激发，并检测其荧光发射（通常在 510 nm 左右）。
  5. 数据分析：计算两个激发波长下的荧光强度比值，并根据已知的钙离子标准曲线，换算成细胞内钙离子浓度。

局限性

虽然 Fura-2AM 是一种常用的钙离子指示剂，但它也存在一些局限性。例如，AM 酯基的水解需要一定的酶活性，这可能导致不同细胞类型的加载效率差异。此外，Fura-2 也会受到细胞内 pH 值的影响，因此在某些情况下，需要进行 pH 值校正。

结论

Fura-2-AM 作为一种细胞内钙离子成像的工具，在细胞生物学研究中发挥着重要作用。其比值测量特性使其具有高度的准确性和可靠性。尽管存在一些局限性，但通过适当的实验设计和数据分析，Fura-2-AM 仍然是研究细胞内钙离子动态变化的有力工具。

参考资料