原理
斑点印迹法基于抗原-抗体反应。首先，将含有蛋白质的样品直接点样到固相载体上，如硝酸纤维素膜或聚偏二氟乙烯（PVDF）膜。之后，使用封闭液封闭载体，以防止非特异性结合。接下来，将膜与特异性抗体孵育，该抗体能够识别目标蛋白质。如果样品中存在目标蛋白质，抗体会与其结合形成抗原-抗体复合物。
实验步骤
- 样品制备：从细胞或组织中提取蛋白质，并进行适当的稀释。
- 点样：将样品点样到膜上，通常使用点样器或简单的移液器。
- 封闭：用封闭液（如脱脂牛奶或BSA）孵育膜，以阻止非特异性结合。
- 抗体孵育：将膜与一抗孵育，一抗特异性结合目标蛋白质。
- 洗涤：洗去未结合的抗体。
- 二抗孵育：加入与一抗结合的二抗，二抗通常带有酶标记或荧光标记。
- 显色或检测：根据二抗的标记类型，进行显色反应或荧光检测，以确定目标蛋白质的位置和相对丰度。
应用
Dot blot 广泛应用于多种研究领域：
- 蛋白质检测：用于检测细胞裂解物、组织匀浆、血清、血浆等样品中的特定蛋白质。
- 抗体滴度检测：用于评估抗体与抗原的结合能力。
- 纯度评估：评估蛋白质纯化过程中目标蛋白的丰度。
- 筛选：快速筛选和分析大量样品。
由于操作简单，成本较低，Dot blot 成为研究人员常用的蛋白质检测方法之一。
优势与局限性
优势：操作简单、快速、成本较低，可同时检测多个样品。局限性：无法提供蛋白质的分子量信息，只能进行定性或半定量分析，特异性不如 Western blot。
结论
斑点印迹法是一种便捷有效的蛋白质检测技术，尤其适用于需要快速评估特定蛋白质存在的场景。虽然它在信息量上不如 Western blot 丰富，但其简便性使其成为实验室研究的重要工具。通过掌握其基本原理和操作步骤，研究人员可以更好地利用该技术来获取关键的蛋白质表达信息。